Cô lập hợp chất thiên nhiên bằng phương pháp sắc kí cột

[phucnguyen860821]

cám ơn các bác. em đang làm bài liểu luận vế cây luc bình nhưng em tìm hoài vẫn không thấy thanh phần hóa học của cây lục bình cả. nhưng dù sao cũng cảm ơn các bác đã chỉ dáo

[power]

Hi moi nguoi,

Minh cung da lam master ve hợp chất thiên nhiên nên ko biết kinh nghiệm này có giúp được cho các bạn không.

Thứ nhất về hợp chất thiên nhiên, khi bạn chọn đề tài thì bạn đã xác định họ hợp chất mà mình cần nghiên cứu. Sau đó chọn cây, hoặc họ cây. Tiếp theo là chọn phương pháp chiết các chất ra khỏi các bọ phần của cây, thượng la ngâm chiêt, chiết soxlet hoặc chiết bằng microwave. Sau đó nếu có nên đi chạy GC-MS hoặc HPLC-MS dịch chiết để xác định các chất trong dịch chiết gồm là gì, chất nào biết rồi, chất nào chưa biết, chất nào cần tách sau đó mới tìm phương pháp tách chất.

Có thể dùng sắc khí cột, dùng HPLC,... tuy nhiên trong diều kiện các bạn làm ở VN nên dùng sắc ký cột vì cái đó các bạn tự làm còn HPLC thi các ban sắc ký cột sơ bộ và gửi đi để nhờ các trung tâm tách.

Đối với sắc ký cột thì mình thấy bạn ancistrocladus đề cập khá kỹ rồi mình cũng xin lưu ý thêm về lượng chất bạn chạy, kích thước cột, lượng chất pha tĩnh cần thiết để tách được các chất vì nếu lượng chất lớn, cột nhỏ thì không thể tách chất ra khỏi nhau đươc (xem bài báo đính kèm). Bên cạnh đó, với HCTN thường tồn tại các dạng đồng phân không gian (có thể R, hoặc S, co thể cis - trans-, alpha,beta,..) những cái đó thì rất khó tách bằng sắc ký cột vì các dạng có thể chuyển đổi qua lại với nhau, nên nhiều trường hợp trong hệ dung môi này thì chỉ có 1 vạch nhưng khi chạy hệ dung môi khác thì nó lại 2 thâm chí 3 đến 4 vạch. Khi đó nên chọn hệ dung môi nào thể hiện 2 vạch rõ ràng và có thể tách bằng HPLC và các bạn chạy HPLC là có thể tách được. (chứ chỉ dựa vào sách ký cột thì thật sự khó để tách được ra chất tinh khiết).

Vấn đề giải phổ thì mình nghĩ là cũng không đến nổi khó lắm đâu. Vì hầu như hợp chât ma các ban tách đã có người nghiên cứu hoặc đề cập trước rồi. Điều cốt yếu là bạn phải có tài liệu tham khảo về nó (ở các bài báo trên các tạp chí). Hồi mình làm để tài thạc sỹ ở VN thấy giải phổ rất khó vì không có tài liệu tham khảo, nhung hiện nay làm PhD ở nước ngoài và có một thư viện tốt thì thấy chỉ cần bạn tách được chất. Đo phổ IR, UV, 13C, 1H,MS giải và so sanh kết quả với các tài liệu là thấy ngay.

Có một kinh nghiệm nữa mình thấy cũng bổ ích với một số bạn là nên đọc tài liệu nhiều trước khi bắt tay vào làm thực nghiệm. Vì nếu bạn không biết mình sẽ làm gì thi khi vào phongd TN các bạn chỉ tốn thời gian thôi. Hay các bạn không biết mình đang tách chất nào thì khi sắc ký cột rất khó mà tách được vì không biết nên chọn hệ dung môi như thế nào.

Mình xin đính kèm hai bài báo khá hay về SKC và phổ NMR nếu các bạn có thắc mắc gì về tài liêu, phổ, sắc ký thì xin cứ trao đổi nhé. (bằng tiếng anh, nhưng mình nghĩ cũng không khó đọc đâu)

Chúc các bạn thành công,
Thân ái,

[xuanthuhathi]

Cho mình hỏi TCM, AcOH là viết tắt của chất gì vậy. mọi người cho mình một số hệ dung môi thật phân cực đc ko,phân cực cỡ Bu:H20:Acid Acetic=411. Cám ơn mọi người

[tigerchem]

mình đoán TCM là tetraclorometan CCl4, AcOH là axit axetic CH3COOH, Ac là viết tắt của nhóm acetyl CH3-C=O, và bạn hỏi hệ thật phân cực để làm gì, chạy cột pha đảo C18, hay để chạy HPLC... thông tin hỏi cụ thể hơn sẽ có giải đáp cụ thể, mình đoán bạn đang tìm hệ phân cực để chạy cột tách chất, bạn có thể nêu thông tin các vết trên bảng chấm TLC của bạn, mọi người sẽ góp ý thêm, thân

[xuanthuhathi]

Mình định tách chất trên TLC thôi vì lượng của mình chỉ có 50mg rồi cạo bản mỏng. Trên bản mỏng, với hệ Bu:H2O:AcOH=50,8 (lấy lớp trên) thì cho vết gần như hình số 8 (thật ra thì 2 vết chồng lên nhau khá khít),ngoài ra còn có tạp nữa.Mình đã thử thay đổi mọi tỉ lệ nhưng không tách đc 2 vết ra, đã chạy qua Clo:Me:H2O=65:35:7, và Bu:H2O:AcOH=51 nhưng vẫn ko tách đc. Chất của mình đc lấy ra từ cột pha đảo, có điều lạ là mình chạy hệ dung môi MeOH:H2O=1:15 mà vết vẫn ở trên đỉnh sát đường dung môi khi đốt có màu tím (chứng tỏ nó không phải là đường?) nên mình dùng hệ MeOH:H2O=1:2 (vết vẫn ở trên đỉnh).Nguồn gốc chất của mình là như vậy,bây giờ lượng còn rất ít nên chắc chỉ cạo bản thôi.

[power]

TCM la triclometan (cloroform), minh chua thay ai chay cot bang ccl4 ca.

[beheo]

bạn thử dùng hệ etyl acetat:acid acetic:nước (5013) xem thế nào nha.Hệ này mình dùng cho pha thường.Nếu được kết quả tốt thì báo cho mình biết với nha.

[xuanthuhathi]

Nguyên văn bởi ancistrocladus

Theo mình thì nên cố gắng tách bằng các phương pháp có sẵn trong Lab của các bạn trước khi đem đi thuê chạy trên pHPLC. Thứ nhất là vì thiết bị này chưa thịnh hành ở VN và thứ hai là tốn kém. Một số điểm bạn cần cố gắng làm trước khi bó tay ngồi chờ cứu viện của các thiết bị mà bạn không có sẵn, theo tôi như sau:
-Cố gắng tách các vết ra khỏi nhau trên bản mỏng phân tích, anlytical TLC-0.25 mm , với sự khác nhau của ∆Rf ít nhất là 0.015. Khảo sát với thật nhiều hệ dung môi khác nhau vì có thể hệ này không tách nhưng sang hệ khác nó lại tách, vì để tạo ra một resolution đủ lớn thì các bạn biết rồi là nó phụ thuộc vào tính phân cực (polarity) và tính lựa chọn (selectivity factor) của hệ dung môi (còn yếu tố khác như pha tĩnh là silica gel thì đã bị cố định bởi nhà sản xuất mất rùi). Các giá trị Rf nên nằm từ 0.25 -0.55 vì trong khoảng này có sự ổn định khi chuyển sang tách trên cột silica gel (40-63 µm) với cùng 1 loại dung môi. Nếu chạy sắc ký cột nhanh FCC thì cần ∆Rf ít nhất là 0.1 thì tách mới dẽ không thì sẽ cần chạy trên cột có chiều cao và chạy chậm để tách các ∆Rf khoảng 0.03. Với các alkaloid thì người ta dùng thuốc thử Dragendoff và hay dùng hệ dung môi TCM/MeOH hoặc TCM/M/nước đôi khi cần thêm các bazo vào như là TCM bão hòa NH3 hoặc bazo hưu cơ. Để thay TCM người ta hay dùng DCM cho đỡ đôc. Như tách hiệu quả thì TCM vẫn hữu dụng hơn dù là trên TLC khoẳng cách Rf gần giống nhau, điều này là do hệ dm có TCM với hệ có DCM thể hiện tính lựa chọn khác nhau. Tính lựa chọn thể hiện rõ nhất khi tách các terpenoids đang dùng hệ dung môi H/EtOAc mà chuyển sang chạy DCM/ AC hoặc TCM/MeOH có độ phân cực tương đương (khoảng cách Rf như nhau), ở 1số ít trường hợp vết thấp chuyển vị trí cho vết cao và ngược lại, cứ như trên RP-TLC vậy.
Với các hỗn hợp phân cực như peptides, saponins, glycosides hoặc flavonoid glycoside thì khó tách hơn, người ta vẫn thích dùng TCM/MeOH/nước như 70/30/3; 30/9/1; 65/25/4; 65/35/10; BuOH/AcOH/H2O = 5/1/4; EtOAc/MeOH/H2O = 8/1/1 hoặc EtOAc/MeOH/H2O/toluene = 100/15/14/2 và rất nhiều hệ khác hiệu quả tách cao. Chúng ta chỉ cần khảo sát kỹ thì chọn được hệ dung môi thích hợp dễ tách, dễ cô cất dung môi, rẻ tiền và không độc hại.
Với các hỗn hợp nhỏ hơn 50 mg thì chay cột nhỏ từ các pipet nhỏ hoặc ai biết đổ pTLC thì càng nhanh, đưa chất lên bản mỏng và triển khai sau đó cạo ra và rửa giải trong 1 pipet nhỏ là đủ. Chỉ cần độ tinh khiết 94-95% là chạy NMR ngon lành rùi. Đôi khi hỗn hợp đồng phân 85-90 % cũng phải chịu thôi.
Cuối cùng nễu qua rất nhiều hệ dm mà vẫn không tách được trên TLC thì thôi đành test thử với RP-TLC vậy thôi. Tiếp theo là tách thử trên RP-SPE như Sep-Pak C18 trước khi dựng cột C18 lên. Nếu mà vẫn không tách được trên open ODS (Đôi khi SEPABEADS hạt nhỏ hoặc Diaion HP-20 chạy với dm MeOH/H2O hoặc Sephadex LH20 với hệ dm H/DCM/MeOH = 5/5/2; DCM/MeOH =5/5 hoặc MeOH lại có thể giải quyết được) thì đành mang ra cầu kiu pHPCL.

Hệ EtOAc:MeOH:H2O=81 không đồng tan, mình đã thử EtOAc:MeOH:H2O=61 mà cũng ko đồng tan (mà có phải EtOAc là viết tắt Ethyl Acetat ko, hic)

[katetrang]

chính xác EtOAc la ethyl acetat, hệ ko đồng tan bạn có thể lấy lớp trên hoặc lớp dưới thử xem

[tie.pok]

Đúng, EtOAc là Ethyl acetat. Nhưng không có chuyện hệ EtOAc:MeOH:H2O = 8 : 1 : 1 không thể hòa tan đồng thể với nhau (chỉ là hơi khó chút xíu thôi à). Bạn nên lắc thật kỹ hệ dm sau khi pha, nếu không được hãy kiểm tra lại độ tinh khiết của dm (có thể trong EtAc và nhất là MeOH trước đó đã lẫn nước). Bạn cũng có thể tăng tỷ lệ của MeOH lên 1.5 hoặc 2, 2.5,... để tìm hệ tách phù hợp với chất của bạn.