Đại cương về phương pháp nghiên cứu cấu trúc phân tử protein
a) Thu nhận protein ở dạng tinh sạch: sử dụng các phương pháp kết tử ở dạng thuận nghịch, sắc kí qua cột trao đổi ion, rây phân tử, phương pháp sắc kí ái lực... để loại bỏ các protein tạp.
b) Xác định thành phần axit amin của protein
Tiến hành các bước như sau:
- Thuỷ phân protein thành các axit amin, thông thường dùng HCN 6 N ở 110 độ C trong 24 giờ.
- Loại axit khỏi dung dịch thủy phân.
- Tách riêng các axit amin trong dịch thủy phân: Có thể dùng phương pháp sắc kí trên giấy, sắc kí kết hợp với điện li trên giấy, sắc kí cột với chất trao đổi ion(thường dùng là polistiren sunphonat như Dowex 50)
- Để định tên các axit amin trong dịch thuỷ phân cần tiến hành phân tích song song 1 mẫu chứa hỗn hợp của các axit amin chuẩn. Đối chiếu so sánh sắc kí đồ nhận được của mẫu nghiên cứu và mẫu chuẩn sẽ biết được thành phần, tỉ lệ từng axit amin trong mẫu nghiên cứu.
- Tính số gốc axit amin trong phân tử.
Ngày nay nhờ có máy phân tích tự động thành phần axit amin, có thể hoàn thành việc tách và phân tích dung dịch axit amin trong vòng 2 giờ.
c) Xác định trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong chuỗi pôlipeptit
Các phương pháp thường được dùng từ trước đễn nay như phương pháp Sanger, phương pháp dùng danxil clorua, phương pháp Edman. Để xác định trình tự axit amin của một chuỗi pôlipeptit thường bao gồm một số bước chính sau đây:
- Cắt chuỗi pôlipetit ở những vị trí xác định tạo thành các đoạn peptit ngắn. Để thực hiện điều này, thường dùng các enzim phân giải protein (tripxin, kimotripxin, clostripain...) các hoá chất đặc biệt(CNBr)
- Dùng phương pháp sắc kí để tách riêng các đoạn peptit này và tinh sạch chúng.
- Xác định trình tự sắp xếp axit amin của mỗi đoạn peptit đã tinh sạch.
- Đối chiếu trình tự axit amin của các đoạn peptit khác nhau( chú ý những đoạn có trình tự axit amin bao phủ lên nhau) để thiết lập trình tự axit amin của toàn bộ chuỗi polipetit.
|