Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Lý thuyết, vận hành, hay chỉ là thực nghiệm!!!
Chào các bạn, tôi là người đang làm việc với HPLC trong ngành dược và có nhiều điều muốn trao đổi với các bạn khi vận hành HPLC.
Đã bao giờ các bạn tự hỏi rằng tại sao ta phải đuổi khí trước khi tiến hành sắc ký, tại sao phải rửa cột ? Việc đuổi khí là cần thiết cho
quá trình phân tách cột và
nhận tín hiệu của detector tốt (đây là
lý thuyết)
. Ở nơi tôi làm, việc đuổi khí chỉ được thực hiện một lần với mổi chai pha động như MeOH, ACN, (với buffer tất nhiên phải được đánh siêu âm ngay khi pha) và phần việc còn lại là của Degasser Online. Và cho tới nay, cách làm này vẫn đạt được những yêu cầu khắc khe của ngành dược (lưu ý rằng tôi chỉ sử dụng Detector UV, DAD, Fluose còn với những loại đầu dò khác tôi chưa kiểm chứng được). Vậy thật sự có cần thiết phải đuổi khí bằng He hay Ar không? (hỏng biết luôn!)
Về vấn đề rửa cột thì mỗi phòng thí nghiệm, thậm chí mỗi người thực hiện mổi kiểu, ví dụ ở nơi tôi làm, việc rửa cột với 100% H2O là không được phép, nhưng bản thân tôi thì thỉnh thoảng vẫn làm vậy
. Thời gian rửa cột thì có nơi rửa 1h , có nơi 2h thậm chí có nơi cả buổi hay cả ngày. Vậy thì rửa cột thế nào mới đúng? Theo kinh nghiệm của tôi thì cách rửa cột tốt nhất là làm theo hướng dẫn của manual (luôn có khi mua cột) nhưng một trình rửa cột như vậy nhiều khi cần 2-3h, bạn có thời gian ko?
. Và cần lưu ý thêm rằng lượng dung môi qua cột cũng có ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột đấy bạn ạ! Đừng mong chờ nơi bán cột hay một người nào đó chỉ dẫn cho bạn cách sử dụng cột tốt nhất, vì họ chẳng bao giờ biết được bạn dùng cột với mục đích gì, cho hoạt chất hay sản phẩm nào,
chính bạn mới là người phải quyết định. Nhưng trước hết để quyết định đúng, chúng ta phải hiểu được những quy tắc cơ bản, và tôi rất sẵn lòng chia sẽ với bạn những kinh nghiệm nhỏ bé của tôi. Khi tiến hành rửa cột nên lưu ý những điều sau:
- Nên rửa cột theo từng giai đoạn với pha động có độ mạnh từ thấp đến cao.
- Khi sử dụng đệm muối, đặc biệt là đệm phosphate, cần rửa với H2O ít nhất 30 phút với cột có kích thước 250-4mm, với cột có kích thước khác có thể tăng hay giảm thời gian.
- Hãy sử dụng MeOH thay cho ACN để rửa cột (điều này là do bản thân mình rút ra từ thực nghiệm)
- Hãy hiểu rõ mình đang rửa cái gì và để chuẩn bị xác định hoạt chất gì, ví dụ: nếu bạn rửa cột sau khi chạy ở pha động MeOH-H2O 80-20 để chuẩn bị xác định một hoạt chất chạy ở tỷ lệ 100% MeOH --> Giai đoạn rửa cột với 100% là cần thiết.
Một trình rửa cột như vậy mất khoảng 45-90 phút và vẫn đảm bảo kết quả phân tích sau (tất nhiên là vẫn có 1% rủi ro không lý giải được
)
Một vài ý kiến mong các bạn trao đổi